小沐同学（AI）|单细胞测序100问(66)-分析篇

Q：单细胞数据质控主要看哪些指标呢？

A：

（1）原始数据质控：单细胞转录组测序获得的原始数据为 fastq（或为压缩文件 fq.gz）格式，每个样本有 read1.fastq.gz 和 read2.fastq.gz两个文件，其中read1 为 barcode 和 UMI 信息，read2 为测序的 RNA 序列信息，后续根据序列标签信息可进行数据拆分及定量。在数据分析过程中，我们首先需要对下机的原始数据进行一系列严格的质控，去除掉低质量数据，保留高质量数据以确保后续数据分析结果的真实性及可靠性。FastQC软件可以快速对测序数据进行整体统计及质量评估，直观地反映出测序数据的好坏。

通过计算每个碱基的质量值，对测序的read 进行质量评估。碱基质量值 Q= -10×Log10(P)，在生物物理学中是碱基识别出错概率的整数映射，用于分析每个碱基被识别错误的概率，其值越高表明碱基识别越可靠。质控标准中的 Q20 表示该碱基错误的概率为 0.01，Q30 表示错误率为0.001。一般Q20在85%以上，Q30在80%以上视为测序质量较好。

（2）细胞过滤：我们在做单细胞测序的时候，首先要做细胞分离。分离条件对某些类型的细胞不适应，造成细胞破碎或凋亡，RNA溢出，导致线粒体基因比例上升，会干扰细胞分群。因此，在Cell Ranger 生成表达矩阵之后，还需要进一步对细胞进行过滤。线粒体过滤的原则为，去除线粒体基因含量过高的细胞，但不能大量丢失样本的细胞信息。目前统计的文章线粒体过滤阈值在5%~30%之间不等，但是一些特殊样本，如肿瘤组织、心脏样本、肌肉样本，因其本身的线粒体含量偏高，固定阈值筛选原则显然是不合适的，故而此标准需要进行调整。

（3）多样本批次矫正：当涉及多个样本进行比较分析时，需要对这些样本进行合并分析和批次矫正，可采用 Harmony 方法对scRNA 数据进行多样本合并和批次效应的校正。

Harmony原理：利用PCA将转录组表达谱嵌入到低维空间中，不同颜色表示不同数据集，不同形状表示不同的细胞类型，然后应用迭代过程去除数据集特有的影响Harmony概率性地将细胞分配给cluster，从而使每个cluster内数据集的多样性最大化；Harmony计算每个cluster的所有数据集的全局中心，以及特定数据集的中心；在每个cluster中，Harmony基于中心为每个数据集计算校正因子；最后，Harmony使用基于C的特定于细胞的因子校正每个细胞。由于Harmony使用软聚类，因此可以通过多个因子的线性组合对其A中进行的软聚类分配进行线性校正，来修正每个单细胞。Harmony算法与其他整合算法相比的优势：整合数据的同时对稀有细胞的敏感性依然很好；适合于更复杂的单细胞分析实验设计，可以比较来自不同供体，组织和技术平台的细胞。