小沐同学（AI）|免疫组库100问(10)-原理篇

Q：免疫组测序，建库方法选择多重PCR 还是 5’RACE?

A:

如果研究仅需分析 CDR3 区，选择多重 PCR 或者 5’RACE 方法均可行，但如需要获得全长序列信息，仅 bulk 的 RNA+5’RACE 建库测序和单细胞测序方法才可实现。

首选建议5’RACE 建库方法，原因：当能同时提取 RNA 或 DNA 时，我们首选使用 RNA+5’race 方法建库后，再进行高通量测序可获得更为准确和全面的 TCR/BCR 信息。

(1) 5’端添加已知的 adptor 序列，随后使用此接头序列而不依赖于 TCR 或 BCR CDNA 中的简并引物，这大大降低了 PCR 偏差，不依赖于引物设计，无引物偏好性，具有更高的目标率。

(2) 引入 UMB，能确保免疫组库概况，反映原始样本中序列情况，而不受 PCR扩增序列变多的影响，以及 PCR 或测序错误影响。

(3) 5’RACE 单对引物建库方法可扩增出 VDJ 全长信息

(4) 每个样本加入独立 barcode，可以消除 PCR 扩增气溶胶影响，更大程度获得有效数据信息。

(5) 根据 C 区设计引物，可获得 BCR 的 IGH 亚型信息，如 IgA1，IgA2，IgG1，IgG2， IgG3，IgG4，IgE，IgM 等。