小沐同学（AI）|免疫组库100问(7)-原理篇

Q：5’ RACE单对引物建库和多重PCR引物建库怎么理解？

A:

（1）5’ RACE单对引物建库：这种方法需要使用具有末端转移酶活性的逆转录酶反转录RNA，从而在cDNA的3‘端加入非模板C寡核苷酸，用于下游的cDNA扩增，非模板C寡核苷酸叫做模板转换寡核苷酸（Template switch oligo，TSO）。在第一链合成过程中，当到达 RNA 模板的 5‘末端时，逆转录酶的末端转移酶活性会在新合成的 cDNA 链的3‘末端添加一些额外的核苷酸。这些碱基充当模板转换 (TS) 寡核苷酸锚定位点。在 TS 寡核苷酸和附加的脱氧胞苷片段之间进行碱基配对后，逆转录酶“转换”模板链，从细胞 RNA 到 TS 寡核苷酸，并继续复制到 TS 寡核苷酸的5‘端。这种方法可以得到包含完整5‘端的cDNA，这意味着可以保留完整的V基因序列。5‘RACE法需要较少的PCR扩增，与多重PCR法相比可以降低扩增偏好，然而这些方法仍然会存在来自PCR、模板转换以及测序的错误。

（2）多重PCR引物建库：由于TCR V基因巨大的多样性，一对引物不足以捕获所有的TCR转录本，所以出现了多重PCR反应。多重PCR方法使用一组与已知V基因互补的正向引物和一组与J或C区域互补的反向引物。在这种引物扩增策略中，首先从T细胞中分离gDNA或RNA，然后采用上述引物对进行多轮PCR扩增，这些引物同时含有用于后续高通量测序的通用序列。Robins等采用这种方法进行深度CDR3β测序发现，TCR库呈现出特定V-J重排偏好。同时发现，不同个体之间初始CDR3β的重合程度远高于平均水平。这些结果表明TCR库并非随机产生的，而存在对某种重排的偏好，这可能是由于在胸腺发育过程中经历了共同抗原的缘故。